免疫印跡檢測(WB)操作步驟 |
發布時間:2017-08-03 18:24:43點擊次數: 作者: |
免疫印跡檢測的主要原理是在蛋白電泳分離蛋白的基礎上,利用抗原抗體之間的特異性結合來檢測目的蛋白,是一種定性能力強并具有半定量檢測能力的免疫分析方法。實驗步驟如下: 1. 樣品制備: 利用RIPA裂解液裂解細胞或組織樣品,4℃、10000g離心10分鐘,取上清液進行蛋白定量,然后將所有樣品校正到同一蛋白濃度,加入5×上樣緩沖液,95℃金屬浴加熱10分鐘,冰浴冷卻樣品。 2. 電泳:配制聚丙烯酰胺凝膠(根據目的蛋白分子量配制不同濃度凝膠),將樣品加入凝膠上樣凹槽,90V電壓和300mA電流條件下電泳至樣品中溴酚藍跑出凝膠。 3. 電轉:取PVDF膜,甲醇浸泡10分鐘,然后將膜置于電轉夾正極(下面墊上海綿墊和濾紙),電泳后的聚丙烯凝膠置于PVDF膜上,排除氣泡,再鋪上濾紙和海綿墊,再將電轉夾置于電轉槽中,120V電壓和300mA電流條件下電轉2小時(根據目的蛋白分子量可以適當調整電轉時間)。 4. 封閉:電轉結束后,取出PVDF膜,利用TBS緩沖液潤洗后,放入5%脫脂牛奶中(TBS配制)室溫震蕩封閉1小時。 5. 一抗孵育:將PVDF膜的目的蛋白區域剪切下來,放到包被封口膜的玻璃板上,在膜上滴加0.5~1.5ml封閉液配制的一抗溶液室溫孵育3小時或4℃過夜。 6. 清洗:將PVDF膜放入TBST(含0.1%吐溫20的TBS)震蕩清洗3次,每次5分鐘。 7. 二抗孵育:將PVDF膜再次放到包被封口膜的玻璃板上,在膜上滴加0.5~1.5ml TBST配制的二抗溶液室溫孵育2小時。 8.清洗:將PVDF膜放入TBST(含0.1%吐溫20的TBS)震蕩清洗3次,每次5分鐘。 9.上機檢測。 |
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