酶聯免疫斑點檢測(ELISPOT)操作步驟 |
發布時間:2017-08-03 18:43:40點擊次數: 作者: |
酶聯免疫斑點檢測是一種高靈敏度的免疫分析方法,特別適合用于檢測細胞分泌的細胞因子,在免疫學研究中發揮十分重要的作用。其主要原理類似于酶聯免疫吸附檢測,是將一種針對待測抗原的抗體(捕獲抗體)包被到覆蓋PVDF膜的96孔板中,將細胞接種到96孔板中培養,細胞分泌的細胞因子與細胞周圍的包被抗體特異性結合,細胞洗脫后,再利用標記生物素的針對待測細胞因子其它表位的檢測抗體結合到待測細胞因子上,然后離心酶標親和素和沉淀型底物反應形成的斑點檢測分泌細胞因子的細胞。實驗步驟如下: 1. 細胞培養:取出包被了捕獲抗體的96孔PVDF板,接種一定密度的細胞,在一定刺激條件下,37℃孵育24~72小時。 2. 清洗:利用蒸餾水洗去細胞。 3. 檢測抗體孵育:PVDF板各孔加入100μl檢測抗體,室溫或37℃孵育1小時。 4. 清洗:倒去檢測抗體,利用洗滌液(含0.1%吐溫20的PBS)清洗PVDF板3次,300μl/孔,每次1分鐘。 5. 酶標親和素孵育:各孔加入100μl酶標親和素,室溫或37℃孵育0.5小時。 6. 清洗:倒去酶標親和素溶液,利用洗滌液清洗酶標板3次,300μl/孔,每次1分鐘。 7. 底物反應:各孔加入100μl酶反應底物,室溫或37℃孵育30分鐘。然后利用蒸餾水清洗3遍洗去底物溶液,待PVDF板自然干燥。 8. 自動斑點計數儀檢測酶聯免疫斑點數量。 |
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